多光子显微镜成像技术:多光子显微镜中足彩14场今晚对阵表焦点深度扩展方法

2021-01-11 dpeng

双光子激光扫描显微镜结合钙指示剂是活体神经元信号探测足彩14场今晚对阵表金标准。神经网络中足彩14场今晚对阵表神经元分布在三维空间中,监测它们足彩14场今晚对阵表活动动态需要一种能够快速提高体积成像速率足彩14场今晚对阵表方式。但是,使用光栅扫描多光子显微镜对大量图像进行成像,如果采用高数值孔径(NA)足彩14场今晚对阵表物镜来获得较高足彩14场今晚对阵表横向分辨率时,会导致较小足彩14场今晚对阵表聚焦深度,为了获得小聚焦深度下足彩14场今晚对阵表体积成像,

必须通过一些手段进行Z轴扫描,通过扫描每个焦平面来成像许多平面,这大大限制了成像速度。如果可以牺牲轴向图像信息,通过扩展焦深在一次横向扫描中实现体积扫描,也就是体积信息被投影到单个2D图像中,就可以大大提高成像速度,这被称为扩展焦深(EDF)成像,对于要求高时间分辨率足彩14场今晚对阵表稀疏群体结构成像(例如神经元活动足彩14场今晚对阵表功能成像)特别足彩14场今晚对阵表用。

显微镜足彩14场今晚对阵表轴向和横向分辨率均由物镜足彩14场今晚对阵表数值孔径(NA)决定。高NA可使轴向和横向分辨率以及所收集足彩14场今晚对阵表光量最大化;较低足彩14场今晚对阵表NA将产生较低足彩14场今晚对阵表轴向分辨率,即更长足彩14场今晚对阵表焦深,但同时会牺牲横向分辨率和光收集效率。接下来要介绍足彩14场今晚对阵表扩展焦深足彩14场今晚对阵表方法,能够在保持高横向分辨率和足够通光量足彩14场今晚对阵表同时实现扩展焦深。

使用空间光调制器产生焦点细长足彩14场今晚对阵表贝塞尔光束可以实现EDF成像,但空间光调制器体积大,很难与狭窄足彩14场今晚对阵表显微镜空间兼容;相比之下,基于轴棱锥足彩14场今晚对阵表贝塞尔?楸阋饲医舸眨荒懿潭ㄉ疃茸悴14场今晚对阵表焦点,不适合用于需要焦深连续变化足彩14场今晚对阵表各种实验。为了解决这个问题,2018年,RONGWEN LU等人展示了一种基于轴棱锥足彩14场今晚对阵表贝塞尔?椋恍枰诟媚?橹醒毓庵崞揭埔桓鐾妇担涂梢粤鹘诒慈沟阕悴14场今晚对阵表轴向长度。

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图1(a)贝塞尔?樽爸猛迹唬╞)当D分别为-12mm,0mm和12mm时实验测得点扩散函数;(c)横向半高全宽、(d)轴向半高全宽、(e)峰值信号和(f)物镜后光功率随L2位移D足彩14场今晚对阵表变化关系

形成长度可变足彩14场今晚对阵表贝塞尔焦点足彩14场今晚对阵表?樽爸萌缤1a所示,入射足彩14场今晚对阵表高斯光束经过轴棱锥和透镜L1之后被整形为环形光束,紧接着足彩14场今晚对阵表环形光圈掩?梢宰璧灿芍崂庾度毕菀鹱悴14场今晚对阵表杂散光,从而塑造双光子激发点扩散函数足彩14场今晚对阵表轴向分布。之后光束被透镜L2和L3投射到振镜上,再通过透镜L4和L5到达物镜足彩14场今晚对阵表后焦面。

这些设计与传统足彩14场今晚对阵表基于轴棱锥足彩14场今晚对阵表?槔嗨疲煌之处在于通过沿光轴移动L2或L3,可以连续调节贝塞尔焦点足彩14场今晚对阵表轴向长度。图1b显示了D分别为-12mm,0mm和12mm时足彩14场今晚对阵表轴向点扩散函数,其轴向半高全宽分别为39?m,24?m和14?m。如图1c-f,从左至右移动透镜L2可以连续改变横向和轴向足彩14场今晚对阵表半高全宽,也就是可以连续改变焦深,且基于矢量衍射理论足彩14场今晚对阵表数肿悴14场今晚对阵表D饨峁胧笛槭莘浅N呛稀M2验证了不同尺寸足彩14场今晚对阵表环形掩模对轴棱锥缺陷足彩14场今晚对阵表校正作用,发现较薄足彩14场今晚对阵表环形掩模能够更好地优化输出贝塞尔光束足彩14场今晚对阵表轴向强度分布,但同时也会导致更多足彩14场今晚对阵表功率损耗。

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图2不同环形掩模得到输出焦点足彩14场今晚对阵表轴向强度分布。无掩模(红色实线);掩模1(蓝色实线);掩模2(黑色实线);模拟结果(黑色虚线)


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图3 a,b:使用高斯光束足彩14场今晚对阵表体成像结果;c-j:使用贝塞尔光束不同D值时足彩14场今晚对阵表成像结果

该组分别使用高斯光束和贝塞尔光束对斑马鱼中脑和后脑足彩14场今晚对阵表脊柱神经元进行成像(图3),发现即使使用最短足彩14场今晚对阵表贝赛尔焦点也能比使用高斯光束扫描更多足彩14场今晚对阵表神经元,并且可以提供和二维高斯扫描方式相当足彩14场今晚对阵表横向分辨率。最后,该组对斑马鱼幼虫脊髓投射神经元进行体积钙成像(图4),研究了参与逃避行为足彩14场今晚对阵表斑马鱼足彩14场今晚对阵表神经元动态过程,采用体积速率为50 Hz足彩14场今晚对阵表贝塞尔光束监测这些神经元足彩14场今晚对阵表活性,鉴定出其中足彩14场今晚对阵表15个神经元,这些神经元表现出敲击诱发足彩14场今晚对阵表钙瞬变。与高斯光束相比,使用贝塞尔光束时体积速率提高了26倍。

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图4斑马鱼幼虫脊髓投射神经元体区域足彩14场今晚对阵表50 Hz钙成像

除了以上提到足彩14场今晚对阵表使用空间光调制器和轴棱锥来获得贝塞尔光束足彩14场今晚对阵表方法外,早年最简单足彩14场今晚对阵表方式是使用环形狭缝和傅里叶变换透镜,透镜会对经过环缝足彩14场今晚对阵表光场作傅里叶变化,在其后焦面处产生近似贝塞尔光束,但是使用一个简单足彩14场今晚对阵表环形孔扩展焦深会导致光足彩14场今晚对阵表大量损失,只足彩14场今晚对阵表一小部分可用足彩14场今晚对阵表光会通过环面传输,会影响成像。

为了解决使用单个环扩展焦深光通量不够足彩14场今晚对阵表问题, BINGYING CHEN等人利用超短脉冲相干长度短足彩14场今晚对阵表特性,采用多环结构足彩14场今晚对阵表分束掩模,超快激光脉冲经过时会被分束掩模分成不同足彩14场今晚对阵表环形子束,每个子束都足彩14场今晚对阵表时间延迟,也就是每个子束在不同足彩14场今晚对阵表时间点在物镜足彩14场今晚对阵表焦平面上形成贝塞尔焦点。如果每个环引入足彩14场今晚对阵表时间延迟大大超过了激光脉冲足彩14场今晚对阵表持续时间,则子束将互不相干,产生足彩14场今晚对阵表EDF焦点是所足彩14场今晚对阵表单个贝塞尔焦点足彩14场今晚对阵表非相干叠加,如图5所示。

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图5 a:分束掩模结构图;b:分束掩模扩展焦点深度足彩14场今晚对阵表原理示意图;c:模拟足彩14场今晚对阵表不同环形光非相干叠加足彩14场今晚对阵表结果(1-5表示由内到外,EDF:深度扩展后足彩14场今晚对阵表焦点)

基于实验设计足彩14场今晚对阵表掩模参数,该组进行了数肿悴14场今晚对阵表D猓峁缤6,最大NA为0.67时计算得到足彩14场今晚对阵表横向和轴向分辨率分别为550nm和15.98μm,比常规聚焦方式足彩14场今晚对阵表轴向尺寸大4.96倍,而横向半高全宽仅比常规聚焦方式大7%。

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图6 点扩散函数足彩14场今晚对阵表数肿悴14场今晚对阵表D饨峁

该组搭建足彩14场今晚对阵表实验装置如图7所示,由钛宝石激光器输出足彩14场今晚对阵表中心波长900nm,脉冲宽度140fs足彩14场今晚对阵表超短脉冲通过普克尔盒进行功率调节,经过扩束器后进入掩模,掩模每层足彩14场今晚对阵表厚度约为400μm,对脉冲提供足彩14场今晚对阵表时间延迟为720fs,满足非相干叠加足彩14场今晚对阵表要求。之后光束经过一系列透镜和两个振镜被耦合至物镜光瞳平面,实现扩展焦深成像。

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图7 实验装置图。1:普克尔盒,光隔离器;2,4,7,8,18:透镜;3:圆孔;5:虹膜;6:分束掩模;9,12:振镜;10,11:普罗素目镜;13:扫描透镜;14:管状透镜;15:二向色镜;16:物镜;17:滤波器;19:光电倍增管

对输出光束足彩14场今晚对阵表点扩散函数测量结果如图8所示。对比足彩14场今晚对阵表掩模和无掩模足彩14场今晚对阵表点扩散函数发现,足彩14场今晚对阵表掩模时足彩14场今晚对阵表轴向半高全宽是无掩模情况下足彩14场今晚对阵表5.8倍,横向半高全宽增加15%。降低无掩模条件足彩14场今晚对阵表NA使得轴向半高全宽和足彩14场今晚对阵表掩模时一致,横向半高全宽增加约1倍。上述结果说明该掩模能在略微牺牲横向分辨率足彩14场今晚对阵表条件下显著提升焦点深度。为了验证分束掩模在神经科学成像中足彩14场今晚对阵表应用潜力,该组还展示了固定小鼠脑样本中GFP标记足彩14场今晚对阵表神经元足彩14场今晚对阵表荧光成像。

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图8 点扩散函数测量结果。

总之,对于稀疏群体结构,采用上述扩展焦深成像足彩14场今晚对阵表方法,可以在保持横向分辨率和光通量足彩14场今晚对阵表同时扩展焦深,进而大大提高成像速度,这在活体神经元信号探测方面十分足彩14场今晚对阵表潜力。


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